《银水湾论坛》网上课堂|高玉龙研究员:有效开展禽白血病净化,检测产品、净化方案、大规模样品检测技术三个因素缺一不可

《银水湾论坛》网上课堂|高玉龙研究员:有效开展禽白血病净化,检测产品、净化方案、大规模样品检测技术三个因素缺一不可

自2016年以来,《银水湾论坛》已成功举办五届。本着“引领中国兽用生物制品产业技术创新与融合发展,构建公益性平台的办会宗旨”,汇聚行业精英各抒己见,聚焦行业健康发展共商良策,力求从不同视角、更高角度为行业同仁们提供一个展示与交流的平台,促进行业技术进步,《银水湾论坛》已成为在业内享有较高盛誉和影响力的行业盛会。《银水湾论坛》网上课堂会继续秉持“创新、融合、发展”的精神,邀请业内大咖做客直播间,为大家构建便捷、有效、公益性的前沿知识学习平台。本次网上课堂由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所与哈尔滨国生生物科技股份有限公司共同主办,牧科传媒承办。

《银水湾论坛》网上课堂第五讲请到了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所高玉龙研究员做客直播间。高玉龙研究员带来《禽白血病流行现状、诊断与净化》主题报告,报告分为禽白血病概述、流行现状、常用诊断技术及特点、净化及案例分析、净化中常见问题分析五个部分。

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专家介绍
高玉龙,研究员,博士生导师,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队首席科学家。科技部中青年科技创新领军人才和中国农业科学院“农科英才”(B类)领军人才入选者。兼任中国免疫学会兽医免疫分会秘书长,中国畜牧兽医学会禽病学分会副秘书长。先后主持国家科技支撑计划、国家自然科学基金等20余项科研项目。发表SCI期刊发表学术论文90余篇。
主要从事禽白血病等病毒性免疫抑制病的流行病学调查、致病机制、防控与净化技术等研究。建立了适合不同鸡群的禽白血病净化技术体系,研制了禽白血病抗原、抗体系列配套检测试剂盒,获得包括国家一类新兽药在内的3个产品证书,诊断试剂盒得到广泛应用,打破了禽白血病诊断试剂盒完全依赖进口的局面,其中禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒已成为我国禽白血病净化使用最为广泛的试剂盒。作为国家动物疫病净化评估专家,参与制定了国家《种禽健康标准》和《规模化养殖场动物疫病净化制度》,指导多个大型育种公司开展禽白血病净化,效果显著。
听课笔记
高玉龙研究员首先对禽白血病进行了概述。禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的家禽重要肿瘤病、免疫抑制病和种源性垂直传播病。ALV分为外源性病毒和内源性病毒。临床上发生禽白血病,由外源性病毒引起。家禽上常见的外源性病毒主要有A、B、J和K亚群ALV。淋巴白血病主要由A(ALV-A)、B(ALV-B)亚群的ALV引起,髓细胞瘤由ALV-J引起。目前在国内严重危害种禽健康的以ALV-J为主。另外,K亚群ALV(ALV-K)为本地鸡里出现的新亚群,其复制能力较弱,但是会干扰禽白血病的净化效果。
禽白血病病毒主要以垂直传播为主,但也有一定程度的水平传播能力,尤其是J亚群禽白血病病毒,水平传播能力相对较强。而内源性病毒由于很少形成完整的病毒粒子,所以没有活的病毒传播,主要通过基因整合到鸡的基因组之后,通过基因组来传播。高玉龙研究员提到,由于水平传播的危害,1日龄前小鸡最易感染禽白血病病毒,这也是提倡育种时分家系、母鸡单独孵化的重要原因之一。

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禽白血病的发病特征包括:
1
传播方式以垂直传播为主,逐级放大,因此禽白血病净化的时候,净化的都是核心群。一般情况下,父母代的鸡群是没有办法进行禽白血病净化的,因为净化的成本太高,付出回报不成比例,这也是垂直传播病的一个重要危害,因此必须从源头控制。
2
4周龄之前雏鸡对该病毒易感,尤其是刚出壳雏鸡最易感,开产前后是发病高峰期。其实所有的禽免疫疾病,如鸡传染性贫血病毒、网状内皮组织增生症病毒等,都是小日龄时最易感,这提示养殖场在育雏的时候,一定要做好生物安全防护,对于禽白血病等禽免疫抑制病的防控非常重要。
3
公鸡和母鸡均可感染,因此净化时公鸡也要检测。感染鸡不一定发病,但感染越早,发病率越高。
4
先天感染的鸡产生免疫耐受,终身带毒和排毒。
5
间歇性排毒,禽白血病病毒的排毒无规律性,所以鸡群净化时,一个世代要检测4-6次,甚至8次,而且还要检测3-5个世代,因此禽白血病净化是一个长期复杂的过程。
高玉龙研究员重点介绍了J亚群禽白血病病毒。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是外源性禽白血病病毒与内源性病毒的重组体。1988年,英国在肉用型鸡中分离出J亚群禽白血病病毒;1999年,中国肉种鸡场首次发现J亚群禽白血病病毒;2002年,中国首次发现蛋鸡自然感染J亚群禽白血病病毒,引起髓样细胞瘤;2008年以来,自然感染鸡群中出现血管瘤病变,导致蛋鸡产蛋率下降、高死亡率。

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2008年以来,蛋鸡、黄羽鸡等地方品种鸡发生禽白血病。J亚群禽白血病病毒严重威胁我国家禽种源安全。

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由于禽白血病的严重危害,禽白血病被纳入《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中。

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随后,高玉龙研究员介绍了禽白血病在国内的流行现状。在蛋鸡上,禽白血病2008年开始广泛流行,由于政府和企业的高度重视,开展了持续的净化工作,现在控制的相对较好;在白羽肉鸡(进口为主)上,2017年开始,部分白羽肉鸡种群也出现了严重的禽白血病;黄羽鸡(地方品种鸡)上,由于抗病力强,饲养环境复杂,感染率相对较高。
进口白羽肉鸡方面,2017年以来,辽宁、山东等地进口白羽肉种鸡发生了严重的禽白血病。主要发生在17-19周的肉种鸡,消瘦,食欲下降,大范围出现弱鸡、瘫鸡。肝脾肿大,龙骨有渗出物的占死亡总数的75%。从发病场采集的疑似禽白血病病料进行了病毒分离鉴定,结果表明8个分离株均为J亚群ALV。

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从四省18个地方品种鸡ALV-J感染情况来看,场的阳性率为100%,个体感染率在0.46%-38.74%之间(数据截至2018年)。说明当时国内地方品种鸡白血病阳性率相对较高,目前通过净化应该稍有好转。

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地方鸡ALV-J分子流行病学研究中,对gp85序列分析溯源之后,发现13年之前的病毒基本上跟国外的序列是同源的,也就是很大程度上国内地方品种鸡的禽白血病病毒是由国外引进鸡传入。

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禽白血病是种源性疾病,该病主要通过种群净化的方式来防控。禽白血病净化有三个要素——检测试剂、净化技术方案和样品大规模检测操作规程。
禽白血病常用的检测技术包括病原检测技术和抗体检测技术。病原检测技术中,病毒分离是金标准方法,ALV抗原ELISA检测试剂盒是禽白血病净化过程中应用最为广泛的检测试剂,ALV抗原检测胶体金试纸条可用于禽白血病的快速检测,另外还有一些实验室检测常用的ALV分子检测方法,用于病毒分型。抗体检测主要使用ALV抗体ELISA检测试剂盒,实验室也会使用ALV间接免疫荧光(IFA)检测方法。
禽白血病常用检测技术特点
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从2008年开始,国内进行了大范围禽白血病的净化。使用的检测试剂盒以进口为主。由于国内禽白血病的试剂盒研制起步晚,国产试剂盒质量不稳定,快速检测技术不成熟,因此成为我国禽白血病检测技术产品面临的困境。为此,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所联合哈尔滨国生生物科技股份有限公司从2010年开始研制禽白血病抗原、抗体检测试剂盒。2016年研制成功禽白血病净化主要使用的检测试剂盒:禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒,获得国家新兽药证书;2020年研制成功国际上首个禽白血病病毒群特异抗原检测试纸条,获得国家一类新兽药证书解决了禽白血病病毒快速检测的技术难题。同时还研制了禽白血病病毒J亚群ELISA抗体检测试剂盒和禽白血病病毒AB亚群ELISA抗体检测试剂盒,以及用于病毒分型的多重PCR诊断技术,目前已经形成了完善的禽白血病检测产品体系。

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养殖场开展禽白血病净化,一般包括以下几个步骤:净化前要了解鸡群品种、生长特点、阳性率以及已开展的净化工作,然后制定适合本场的净化技术方案;在此基础上,对养殖场的技术人员进行检测技术培训,逐渐建立大规模样品检测操作规程和检测队伍,保质保量开展鸡群的净化;随时对鸡群净化效果进行分析评估,实时调整优化净化方案。
禽白血病净化技术方案(常规)
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和免疫程序一样,禽白血病无统一的净化方案,每个鸡场都应该有适合自己的净化方案。鸡群饲养/育种环节的协调、兽医与育种专家的协调、实际操作的方便性与可能性等因素都是制定净化技术方案需要考虑到因素。图片
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高玉龙研究员指出,有效开展禽白血病净化,高质量的检测产品、合适的净化方案、完善的大规模样品检测技术是关键的三个因素。
高玉龙研究员强调了禽白血病净化的注意事项。
首先是试剂盒质量与规范操作。试剂盒的质量主要指试剂盒的稳定性和敏感度,试剂盒的稳定性和敏感度不够,会严重影响结果的判定。操作规范是保障试剂盒质量、保证试剂盒检测结果准确的关键,例如试剂盒储运过程当中是否规范、整个操作过程是否严格按照说明书执行等等。
其次是采集样品质量。如进行病毒分离的血浆样品的采集,能不能保证无菌、全程低温及不凝血,是最基本的三个要求。
第三是检测人员技术水平。采样、样品处理、样品检测等方方面面,检测人员的技术水平都会直接影响结果。每个方面检测人员的技术水平必须达到要求,操作必须规范。
第四是结果分析。结果分析非常重要,且有很强的专业性,对禽白血病病毒的复制特性、流行特点必须有深入的掌握和了解。禽白血病的净化结果分析直接影响了下一步净化方案的优化,如检测样品的数量、种类是否需要调整,根据阳性率的降低,检测次数是否需要调整,这些都是基于检测结果进行调整的。
最后是其他免疫抑制病混合感染。其他免疫致病的骨骼感染会严重影响白血病净化鸡群的健康状况。
最后,高玉龙研究员对禽白血病病毒样品的种类和特点进行了总结分析。
胎粪样品检测
·检测方法:群特异抗原检测(ELISA /试纸条)·采集时间:1日龄

·特点:适合雏鸡1日龄检测

肛拭子样品检测
·检测方法:群特异抗原检测(ELISA),偶尔会进行病毒分离·采集时间:母鸡开产前

·特点:方便,但会有假阳性

蛋清样品检测
·检测方法:群特异抗原检测(ELISA)·采集时间:初产,留种前

·特点:特别适用于母鸡检测

 

抗凝血样品检测
·检测方法:病毒分离·采集时间:母鸡开产前或整个饲养周期,公鸡整个饲养周期

·特点:结果准确、操作复杂、成本高

 

临床样品检测
·样品类型:抗凝血、组织样品(肝、脾、肾、肿瘤等)、血清·检测方法:病毒分离、分子生物学方法、抗体ELISA方法

 

疫苗外源病毒检测
·检测方法:- 药典推荐方法:中和病原后进行病毒分离,上动物法

– 群特异抗原检测(ELISA /试纸条)或分子诊断方法进行初筛

·特点:不同疫苗处理方法不同、有难度、PCR检测要慎重

不能扩增p27基因
不能直接扩增gp85基因
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企业介绍
哈尔滨国生生物科技股份有限公司(动物用生物制品国家工程研究中心,以下简称国生生物)是经国家发改委批准,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牵头,联合中国兽医药品监察所等企事业单位共同组建、具有独立法人资格的科技型高新技术企业,是动物生物制品行业内唯一的国家级工程研究中心。形成了从动物生物制品的研发、孵化、转化到生产和销售的全产业链,建立了多个开放性技术平台,成为国内领先的动物生物制品新产品的创新基地、孵化基地和示范性生产验证基地。
文字整理:牧科传媒 何杭艺

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